Главная страница
qrcode

нетает деятельность эндокринной части поджелудочной железы в присутствии аскорбиновой кислоты двухвалентное железа становится ис. Гбоу впо амурская государственная медицинская академия Росздрава удк 611-018. 1 616-01 616-018 612-086


НазваниеГбоу впо амурская государственная медицинская академия Росздрава удк 611-018. 1 616-01 616-018 612-086
Анкорнетает деятельность эндокринной части поджелудочной железы в присутствии аскорбиновой кислоты двухвалентное железа становится ис
Дата16.12.2017
Размер2.43 Mb.
Формат файлаdoc
Имя файлаZinovev_S.V_Metodichka_Gistohimiya-79255.doc
ТипДокументы
#49
страница1 из 6
Каталогolderfiles/1

С этим файлом связано 2 файл(ов). Среди них: Trehccvetnyi_metod_vyyavleniya_bil-51141.doc, Zinovev_S.V_Metodichka_Gistohimiya-79255.doc, Himicheskaya_fiksacciya_kletok_pri-18608.doc.
Показать все связанные файлы
  1   2   3   4   5   6


ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия Росздрава
УДК: 611-018.1: 616-01: 616-018:612-086

Целуйко С.С., Зиновьев С.В.
Предполагаемые механизмы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме.

(Методические рекомендации)

Благовещенск 2013.

УДК:611-018.1:616-01:616-018:612-086

Целуйко Сергей Семенович, Зиновьев Сергей Викторович

«Предполагаемые механизмы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме». (Методические рекомендации) ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия г. Благовещенск 2013 г.- 40с.
Рекомендовано к изданию научно-методическим советом АГМА и РИС © ЦНИЛ ГОУ ВПО АГМА Росздрава 2013.

Оглавление


  1. Введение. Основы гистохимического анализа целостности организма. 4 стр.

  2. Методы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме. . 14 стр.

  3. Предполагаемые механизмы методов гистохимического исследования неорганического кальция, железа и витаминов в кровеносных сосудах респираторного отдела легких и в клетках периферической крови при коррекции экспериментального стресса дигдрокверцетином . 20 стр.

  4. Предполагаемые механизмы кристаллизации биологических жидкостей в организме человека при коррекции стресса дигидрокверцетином 41 стр.

  5. Выводы. 34 стр.

  6. Литература. 35 стр.




  1. Введение. Основы гистохимического анализа структурной целостности организма, в аспекте микроскопической техники.

В настоящее время в классической морфологии выявление биологических структур осуществляется путем окрашивания клеток, тканей, межклеточного вещества с помощью адсорбционных и протравных красителей. С помощью методов гистохимии выделяются следующие металлы: железо, кальций, калий, цинк, ионы натрия, свинца, серебра, никель, алюминий, барий, золото, бериллий, медь, ртуть, платина, палладия и др. Несмотря на то, что морфологические исследования, содержания кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме начались уже боле 100 лет назад, гистохимические методы их выявления остаются до сих пор недостаточно изученными. По этому целью этой работы являлось изучение предполагаемых механизмов гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме. По мнению авторов фундаментальных руководств по микроскопической технике гистохимическое выявление неорганических веществ в микроскопии основано на следующих принципах: 1) образование лаков, 2) образование хелатов, 3) образование окрашенных солей, 4) замещение одного иона на другой с последующим выявлением. (Волкова О.В. и Елецкий Ю.К., 1971;     Кисели Дьердь, 1962;    Коржевский Д. Э., 2007;  Лили Р., 1969;   Меркулов Г. А., 1969, 1980;  Ромейс Б., 1954;   Лили Р., 1969 Луппа Х., 1980; Саркисов Д. С. и Перов Ю.Л., 1996; Сапожников А. Г., Доросевич А. Е., 2000; Фрайштат Д. М. 1980; Шорманов С. В., 1998; Пирс Э., 1962). Учитывая то, что биофлавониды, будучи витаминами, обладают выраженным свойством к образованию хелатных соединений ионами неорганического железа, свинца, кальция, и др. мы предполагаем, что биофлавоноиды наряду с ДНК и РНК определяют реакцию ядра и цитоплазмы клетки на гистохимические красители (Зиновьев С.В., 2012). Нельзя исключать, что в случае гистохимического окрашивания выявляются нанокристаллы, которые содержат витамины и неорганические вещества. В свою очередь, ввиду нарушения анатомической целостности организма, во время получения, фиксации и гистохимического исследования клеток, тканей происходят существенные изменил строения биоструктур. Комплекс нарушений строения биоструктур обусловленных вмешательством морфолога в организм остается мало изученным.

Французский гистолог и цитолог Анри Поликар был первым исследователем, который применил методы кристаллографии для исследования гистологических препаратов, которые были изготовлены путем микросжигания-сподографии. Кристаллография является фундаментальным направлением основной целью, которого является анализ химического состава и пространственной организации вещества, которое обусловлено существованием кристаллической решетки, стехиометрической структурой сложных молекул. Нативные секреты трахеи и бронхов кристаллизуются в случае дегидратации на цитологическом препарате. По этому, в случае изготовления цитологического препарата, кристаллизация, происходящая во время высыхания цитологического мазка более точно отражает существо способа морфометрического исследования клеток содержащихся в биосредах, и качество исследования морфометрических параметров клеток содержащихся в нативных биологических жидкостях (без добавления натрия хлорида). В свою очередь, известна кристаллизация биологических жидкостей на предметном стекле, которая отражает сложные физико-химические процессы в организме, влияющие на изготовление цитологического препарата в случае процесса высыхания биосред на предметном стекле. Следовательно, кристаллизация нативных по своему химическому составу биосред, вскрывает физико-химические процессы, влияющие на особенности адгезии и распластывания клеток на предметном стекле, и др. подложках возникающих во время высыхания биологических жидкостей на цитологическом препарате. С помощью электронной микроскопии нами установлено, что на клетках легких содержащихся в бронхоальвеолярном лаваже, в такой ситуации оседают кристаллы натрия хлорида, а это в свою очередь отражает изменение осмолярности биосред и деформацию клеток обусловленных дегидратацией в момент высыхания мазков на предметном стекле и др. подложках (Целуйко С.С. и др. 2012). Кристаллизация характеризует технические условия высыхания биологических жидкостей и клеток на предметном стекле и др., а так же характеризует кинетику дегидратации клеток, происходящий в процессе изготовления цитологического препарата, зависящий от химического состава биологических жидкостей, который при этом имеет клинико-диагностическое значение. Учитывая фундаментальное значение кристаллографии в химическом анализе вещества, способность к кристаллизации биологических жидкостей используется, в качестве метода оценки строения организма.

В нашей работе мы обратили внимание на гистохимическую характеристику ряда цитологических симптомов, которые характеризуют дыхательную функцию организма. Методы Перлса и Тирмана являются признанными способами выявления ионов неорганического железа с помощью реакции образования гранул берлинской лазури, турнбулевой сини. С помощью гистохимического исследования локализации неорганического железа выявляются патологические пигмент-гемосидерин, специфический белок ферритин, которые содержатся в кристаллическом виде в эритроидных клетках, эритроцитах, макрофагах, и др. Учитывая технический результат, методы гистохимического выявления неорганического железа содержащихся в клетках и тканях необходимо отнести к методам морфологического окрашивания биологических структур, которое осуществляется с целью изучения целостности организма. По этому целесообразность их использования аналогична обычным методам окрашивания мазков крови, красного костного мозга, срезов органов красителем Романовского-Гимза, гематоксилин-эозином с помощью, которых обнаруживаются пигменты в макрофагах, гипохромные эритроциты, полохироматофильные и окисфильные нормобласты. По этому преимущество гистохимических методов выявления неорганического железа заключается в том, что оно уточняет результаты морфологического исследования кровоизлияний, травматизации, дистрофии, атрофии и др.

Стандартные методы выявления гемосидерина с помощью реакции Перлса и турнубулевой сини (по Саркисову Д.С., 1996) имеют многочисленные недостатки, а именно высокую чувствительность к присутствию ионов железа на поверхности лабораторной оборудования, и лабораторной посуды. Даже в случае использования стеклянных инструментов нельзя исключить появление артефактов, что подтверждается при исследовании лабораторной посуды, которая используется при окрашивании при температуре 500 или 600 градусов по Цельсию. По этому гистохимические подходы, к исследованию клеток основанные на окрашивании эритроцитов с помощью ализарина и нитрата серебра существенно уточняют результаты морфологического исследования гемсодержащих пигментов.

При этом мы так же обнаруживаем, то, что ализариновый красный С окрашивает кровеносные сосуды органов дыхания, и эритроциты. При окрашивании мазков крови ализариновым красным С отмечается то, что клетки крови окрашиваются гранулярно и диффузно (рис. № 10). Гранулярное окрашивание эритроцитов азуровыми красителями в виде базофильной пунктуации характерно в случае свинцовой интоксикации. Тельца Гейнца другой случай гранулярного окрашивания эритроцитов, который обнаруживается при гемолитических анемиях, при отравлении нитробензолом, анилином, сульфаниламидами и др. Ввиду этого обращает на себя внимание гранулярное окрашивание ализариновым красным С эритроцитов периферической крови, которое мы обнаружили ранее (Зиновьев С.В. 1988). Эти данные были подтверждены в работах других авторов, которые изучали механизм окрашивания лейкоцитов на мазках периферической крови с помощью оригинального метода окрашивания ионизированного кальция (Кириченко В.И., Дорофиенко Н.Н., 2000). Полученные нами данные подтверждают данные других авторов о существовании слоя ионов натрия, кальция, железа цинка под мембраной клеток. С помощью антимоната при электронной микроскопии под мембранной клеток был обнаружен слой ионов натрия и др. ионов металлов. В то же время на момент исследования было непонятно значение субмембранного слоя ионов металлов (Bulger R.E., 1969;Simson J.A., Spicer S.S.,1975, Tandler C.J., Kierszenbaum A.L. 1971;Tisher C.C., Weavers B.A., Cirksena W.J.1972, Aguas A.P., Nickerson P.A., 1981;Bowman R., Siegel I.A.,1973).

В настоящий момент установлено, что биофлавоноиды являются важнейшим компонентами продуктов питания человека и адпатогенами, которые эффективно корригируют холодовый стресс (Доровских В.А.,Целуйко С.С., Бородин Е.А., 2009). В силу того, что неизвестными остаются надежные цитологические маркеры воздействия биофлавоноидов и дигидрокверцетина на организм, мы предположили, что гистохимические реакции, выявляющие аскорбиновую кислоту, двухвалентное железо, кальций в тканях респираторного отдела легких могут стать тестами оценки адаптивной роли дигидрокверцетина в случае переохлаждения организма.

В нашем гистохимическом исследовании подтверждается проникновение препаратов дигидрокверцетина в органы дыхания экспериментальных животных, при котором он видимо, вступает в хелатные взаимодействия с микроэлементами (Зиновьев С.В., 2012). В нашем исследовании имеется четкая корреляция, между окрашиванием спирт-ацетатным раствором нитратом серебра и ализарином красным клеток крови, клеток респираторного отдела легких. При исследовании экспериментального материала отмечается гранулярное окрашивание цитоплазмы эритроцитов, лейкоцитов, клеток стенки кровеносных сосудов (рис. №1). Аскорбиновая кислота является важной частью продуктов питания. Гистохимическое исследование аскорбиновой кислоты осуществляется с помощью реакции Жиру-Леблона. В тоже время, известно, что при проведении гистохимических реакций азотнокислое серебро взаимодействует с цинком, кальцием, по этому механизм реакции Жиру-Леблона остается неизученным.

Поэтому мы считаем, что реакция Борнтрейгера в клетках крови и органов дыхания уточняет и подтверждает результаты исследования, полученные при окрашивании клеток с помощью реакции Жиру-Леблона. Таким образом, гистохимические методы являются подходом для исследования хелатных соединений биофлавоноидов с катионами металлов в тканях и микроциркуляторном русле органов дыхания, а так же отражают участие аскорбиновой кислоты в метаболизме дигидрокверцетина, которое локализовано в стенке вен органов дыхания, что может объяснить адаптивную активность биофлавоноидов. В случае гистохимического изучения микроэлементов исследование биофлавоноидов обусловлено биохимическим свойствами этих веществ, которые придают им статус витаминов. Известно, что биофлавоноиды, будучи хелатами способны связывать ионы неорганических форм металлов, тем самым регулировать процесс перекисного окисления липидов. При этом остаются не известными методы гистохимического выявлении биофлавоноидов и катехинов. В такой ситуации, обращает на себе внимания перспектива использования взаимодействия биофлавоноидов с формалином и соляной кислоты (реакция Стиасни), а так же с ванилином, железо-аммичными квасцами, бихроматом калия, ацетатом свинца, которые приняты стандартом в случае биохимического анализа растительного сырья в качестве гистохимической реакции.

Гистохимическое исследование Na+ орального секрета проведенное нами с помощью антимоната вскрывает ряд механизмов взаимодействия биологических сред, белков и клеток с поверхностью предметного стекла (рис. № 9,11). По мнению крупнейшего специалиста в области адгезии клеток Дж. Тринкауса 1972, Na+ , который содержится в большом количестве мягких сортов лабораторного стекла (содовое стекло) очень сильно усиливает адгезию клеток на поверхности препарат. Эти данные впервые экспериментальным путем получил Раппопорот (Rappoport C. et all, 1960, 1966), с точки зрения этих исследователей ионы Na+ определяют клеточные контакты. С нашей точки зрения, гистохимическая реакция, направленная на выявление Na+ в клетках, микроорганизмах, кристаллов орального секрета, подтверждает эту гипотезу.

Арборизация биологических секретов является одним способов оценки фертильности у женщин, в момент овуляции так же повышается температура половых путей, в последующем изменяется тип клеточных реакций влагалищного содержимого. Для изучения арборизации, в отделяемом половых путей и оральный секрета добавляются кристаллы натрия хлорида. По нашим данным арборизация назального секрета, орального секрета происходит в гипотонических-безсолевых условиях (Зиновьев С.В. и др., 2011, Целуйко С.С. и др. 2011). По мнению ряда авторов арборизация бронхоальвеолярной жидкости характерна для септических и деструктивных заболеваний легких, при которых развеется фебрильная температура тела (Катыхина Ю. И., Кондрахина А. П., Даниленко, С. А., Афанасьева Ю. И., 2011). Мы считаем, что для гистохимии арборизация-кристаллизация биологических жидкостей, которая развивается в гипотонических условиях в случае патологии, гормональных реакций, имеет принципиальное значение, так как доказывает фундаментальный характер отложения продукта гистохимческой реакции на биоструктурах. Мы предположили, что при высыхании биологических жидкостей на предметных стеклах и подложках происходит процессы близкие, тем которые используются в промышленном производстве натрия гидрокарбоната. Существо реакции заключается  выпадении особых кристаллов в насыщенных растворах натрия хлорида NH3 + H2O + CO2 + NaCl / NH4HCO3 → NaHCO3 + NH4Cl. Эта реакция известна под названием, которую дали в честь известного бельгийского химика Сольве. Учитывая фундаментальное значение NH3 в формировании аминогрупп аминокислот (NH2), нельзя исключать амидный механизм реакции NaCl / NH4HCO3 . Эта точка зрения подтверждается при исследованиях, которые проводились с помощью растровой электронной микроскопии. Мы провели ультраструктурную оценку морфологии продуктов кристаллизации назального секрета, мокроты, орального секрета, бронхоальвеолярного лаважа, которые образуются при высыхании биологических жидкостей в процессе изготовления цитологического препарата (Зиновьев С.В. и др. 2011, Целуйко С.С. и др., 2011). Учитывая данные растровой электронной микроскопии, у нас сложилось впечатление, что различные производные органического азота и мочевины активно участвуют в процессе кристаллизации биологических жидкостей содержащих натрий хлорид. В кристаллограмме назального и орального секрета и др. обнаруживаются кристаллы: мочевины, натрия хлорида, цистеина, струвиты, солей кальция, лизоцим и др. В настоящее время в эритроцитах и других клетках обнаружены биоминеральные комплексы, имеющих кристаллическую структуру содержащие нанобактерии (Martel J, Young JD., 2008). Патогенное воздействие нанобактерий на организм человека в настоящий момент активно исследуются. Эта точка зрения подтверждается тем, что микроорганизмы участвуют в кристаллизации биологических жидкостей, которая происходит в случае высыхания на предметном стекле. Нами совместно с кафедрой госпитальной терапии Амурской медицинской академии было обследовано 46 больных ХОБЛ среднего и тяжелого течения в стадии обострения (Целуйко С.С., Зиновьев С.В., Даниленко С.А.,   2012). Соотношение лиц со среднетяжелым и тяжелым течением ХОБЛ составило 50%. Всем больным, до и после курса терапии выполня­лась диагностическая фибробронхоскопия с забором бронхоальвеолярного лаважа, который извлекался по оригинальным методикам Ткачевой C.И., 1998. По своим свойствам он идентичен так называемому бронхоальвеолярному смыву. Процедуры начинали с введения 10 мл теплого физиологического раствора в субсегментарный бронх средней доли правого легкого при эндоскопическом исследовании. Из промывной жидкости делали 2 мазка на предметном стекле и на подложке из алюминиевой фольги. После высыхания жидкости, сухой остаток изучался под световым микроскопом и сканирующим электронным микроскопом S-3400 Hitachi (Япония). Мазки клеток бронхоальвеолярного лаважа фиксировали в парах формалина по Гомори, окрашивали по методу Романовскому – Гимза. Химическая идентификация кристаллов мочи в случае мочекаменной болезни проводится на основании оценки растворимости веществ в органических растворителях и минеральных кислотах (Миронова И.И., Романова Л.А.,2002; Кост 1974). По этому в целях химической идентификации химического состава кристаллов на мазки БАЛ наносили органические растворители и кислоты, после чего препараты тщательно промывали в дистиллированной воде и окрашивали цитологическими красителями. При световой микроскопии и растровой электронной микроскопии не фиксированных (нативных) препаратов БАЛ в полях зрения обнаруживаются клетки и кристаллы разнообразной формы: лист папоротника, древовидные, прямоугольные и т.д., которые появляются в результате кристаллизации бронхиального секрета. У 70% обследованных пациентов с ХОБЛ в не фиксированных препаратах бронхоальвеолярного лаважа появляются кристаллы, которые обнаруживаются при маленьком увеличении микроскопа менее ×50. Это обусловлено тем, что в препаратах обнаруживаются агломераты крупных кристаллов, с массивными стеблями. Результаты нашего исследования указывают на то, что фиксация в парах формалина цитологических препаратов бронхоальвеолярного лаважа позволяет дополнительно получать кристаллографические характеристики кристаллограммы, что позволяет диагностировать обменно-трофические нарушения в слизистой оболочке органов дыхания у пациентов с ХОБЛ. Отмечается отложение кристаллов на периферии цитоплазмы клеток. При этом в макрофагах отмечается вакуолизация периферических отделов цитоплазмы. Присутствие кристаллов кальция в цитоплазме клеток бронхоальвеолярного лаважа подтверждено при трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов бронхоальвеолярного лаважа. В то же время менее изучены клинико-морфологические особенности гистохимии кальция в случае развития дистрофии. Учитывая большую актуальность пробы Сулковича, следует признать клинико-морфологическое значение выявления ионов кальция с помощью оксалата аммония. При этом в случае митохондриапатий при заболеваниях почек, отмечаются отложения ионов кальция в матриксе митохондрий. Признаются репрезентативными отложения кальция в митохондриях лимфоцитов (Никитина Л.П., Соловьева Н.В., Максименя М.В. Гомбоева А.Ц., 2012; Клембовский А.И.,2000). Нами установлено, что в митохондриях лимфоцитов обнаруживаются кристаллы кальция. Микроорганизмы в препаратах бронхоальвеолярного лаважа формируют крупные скопления - микробные «пробки». Микроорганизмы входят в состав, кристаллов формирующих «симптом листа папоротника» в препаратах бронхоальвеолярного лаважа. Мы обнаружили, что после обработки серной или соляной кислотами мазков бронхоальвеолярной жидкости пациентов с ХОБЛ, которая проводилась в целях окраски по Цилю-Нильсену, микроорганизмы слабо окрашиваются метиленовым синим, симптом «листа папоротника» при этом сохраняется. Ввиду этого мы обратили внимание на то, что в случае фиксации в метаноле цитологических препаратов БАЛ, которая продолжалась в течение пяти минут, отмечается умеренная растворимость кристаллов «симптома листа папоротника», что указывает на присутствие жирных кислот и нейтральных липидов. Таким образом, в случае фиксации в парах формалина мазков бронхоальвеолярного лаважа, нами отмечается нерастворимость кристаллов в водном растворе красителя Романовского-Гимза, этаноле, серной кислоте, соляной кислоте, уксусной кислоте (рис. № 13,12,13,14,15,16,17,19,20). По этому результаты наших исследований указывают на присутствие в составе кристаллов в препаратах бронхоальвеолярного лаважа мочевины, мочевой кислоты и её производных, а так же цистина, других аминокислот которые являются продуктами распада белков и нуклеопротеидов. Ранее, мы с помощью растровой микроскопии препаратов бронхоальвеолярного лаважа у экспериментальных животных уточнили тип изучаемых кристаллов. В кристаллограмме, бронхоальвеолярного лаважа обнаруживаются кристаллы, которые характерны для осадка мочи: мочевины, натрия хлорида, цистеиновые, струвиты, соли кальция, лизоцим и др. При этом мы отмечали достоверное воздействие магнитного поля на кристаллографические характеристики бронхоальвеолярного лаважа, что с нашей точки зрения говорит о присутствии в составе кристаллов ионов железа (Зиновьев С.В. и др., 2010). В классическом способе оценки симптома листа папоротника в случае оценки овариального цикла или исследования дыхательных путей, для обнаружения кристаллов в биологическую жидкость добавляется натрий хлорид Татарчук Т.Ф., Сольский Я.П. (2003). Учитывая результаты своего исследовании механизма арборизации, мы отказались от добавления в биологическую среду натрия хлорида в целях кристаллизации секрета.

Известно, что при окрашивании азур-эозиновым красителем эритроциты обладают слабощелочной реакцией, по этому окрашиваются эозином. При этом в кислой среде эозином окрашиваются и более кислые структуры. Азур 2 окрашиваются слабокислые структуры, ядро и базофильная цитоплазма, в щелочной среде. При этом азуром в щелочной среде окрашиваются и эритроциты. Гранулы лейкоцитов окрашиваются в нейтральные тона. При этом отмечается обратная взаимосвязь с рН красителя при разных методах окрашивания. По нашим наблюдениям в случае холодового стресса появляются полихроматофильные эритроциты, гемоглобин которых теряет свои слабощелочные свойства, а это уже полностью уточняет результаты цитологичесого исследования. При оценке воздействия дигидрокверцетина на холодовый стресс гранулярное окрашивание нитратом серебра цитоплазмы лейкоцитов, а так же эритроцитов, мы расценили как результат позитивного воздействия дигидрокверцетина на адаптацию к общему охлаждению организма (рис. № 2,3,4) По данным литературы (Т.Н. Кропачева, А.А. Леконцева, В.И. Корнев 2011) ализариновый красный С обладает свойством индикатора рН среды. С помощью спектрофотометра изучены спектры поглощения ализаринового красного С при различных значениях кислотности растворов. В кислой среде (до рН<4) реагент имеет желтую окраску с максимумом поглощения при 420нм. При дальнейшем подщелачивании раствора наблюдается постепенное уменьшение этого максимума с одновременным ростом новой полосы поглощения при 515нм, при этом раствор приобретает красно-оранжевый цвет. Изменения спектров характеризуются наличием изобестической точки при 460нм. В щелочной среде (рН>10) происходит дальнейшее длинноволновое смещение максимума до 550нм (изобестическая точка 510 нм), при этом окраска раствора становится фиолетовой.

Эта точка зрения подтверждается при окрашивании ядра и цитоплазмы по Мак-Ги Расселу в слабощелочной среде: нуклеиновая кислота, содержащаяся в ядре интенсивно окрашивается, цитоплазма слабо окрашивается, эритроциты хорошо окрашиваются ализарином (рис .№ 5). В случае влажного окрашивания спиртовым р-р ализариновым красным С ядра и цитоплазмы клеток р-р слабокислым ализарином красным С (менее кислая цитоплазма хорошо окрашивается, ядро отрицательно реагирует с ализарином не окрашивается, слабощелочные эритроциты по-прежнему окрашиваются интенсивно). В такой ситуации обнаруживается интенсивное прокрашивание ализарином нейтрофильной цитоплазмы сегментоядерных лейкоцитов (рис. №6). Это говорит, о том, что, скорее всего при обоих методах окрашивания возникает адсорбционное взаимодействие красителя и цитоплазматических структур, которое происходит по типу лакмусовой бумаги. По этому, позитивное воздействия дигидрокверцетина на течение экспериментального холодового стресса отражает отчетливое гранулярное окрашивание эритроцитов возникает, в случае промывания цитологических препаратов крови в растворе протравы, а именно бихромате калия (рис. № 10). По этому необходимо учитывать, то, что при реакции Стиасни- Ванилин происходит гранулярное окрашивание в эритроцитах (рис .№ 1), которое указывает на присутствие флавоноидов в клетках, а так же то, что биофлавоноиды реагируют с клеткой путем осаждения с бихроматом калия. Мы этому мы предположили, что влажное окрашивание ализарином красным С позволяет выявлять биофлавоноиды в эритроцитах периферической крови. При этом гистохимическом исследовании ионов железа, кальция, цинка и др. в органах дыхания и периферической крови в эксперименте подтверждается позитивное воздействие биофлавоноидов на холодовую адаптацию. Следует, учитывая предполагаемый механизм гистохимических реакций при окрашивании клеток. микроорганизмов спирт-ацетатным р-р нитрата серебра и ализариновым красным С, антимонатом калия, дитизоном определяется присутствием большого спектра ионов микроэлементов. По этому складывается впечатление, что биофлавоноиды в качестве хелатных соединений могут определять комплексное гистохимическое окрашивание аскорбиновой кислоты, кальция, цинка, железа в клеточных элементах плоского эпителия, легочных макрофагов, лейкоцитах, эритроцитах. По-видимому, гистохимические подходы, к исследованию клеток основанные на окрашивании с помощью ализарина и нитрата серебра отражают: тромбоз кровеносных сосудов, агрегацию эритроцитов, гемолиз, в фагоцитоза эритроцитов макрофагами, миграции лейкоцитов в ткань респираторного отдела легких. При этом учитывается и изменение сродство красителю цитоплазмы и ядрышка, аналогичные базофилии или оксифилии. Возвращаясь к анализу цвета гранул, которые появляются при соединении ализарина с микроэлементами, следует учитывать, что для ионов кальция характерен оранжево-красный, кирпично-красный цвет, а для ионов железа вишнево-красный цвет. При этом следует учитывать, что бихромат калия, который выступает в качестве протравы для ализаринового красного С:

1) является гистологическим фиксатором

2) вступает в хромаффинную реакцию биогенными аминами и др. нейромедиаторами.

3) осаждает биофлавоноиды и полифенолы из растительных экстрактов

Следовательно, гранулярное окрашивание эритроцитов ализарином может быть объяснено взаимодействием красителя с гемоглобином. В нашем исследовании имеется четкая корреляция, между результатами окрашивания спирт-ацетатным раствором нитрата серебра и ализарином красным клеток крови. Поэтому мы считаем, что реакция Борнтрейгера в клетках крови и органов дыхания уточняет и подтверждает результаты исследования, полученные при окрашивании клеток с помощью реакции Жиру-Леблона. В нашем гистохимическом исследовании подтверждается проникновение препаратов дигидрокверцетина в органы дыхания экспериментальных животных, при котором он видимо, вступает в хелатные взаимодействия с микроэлементами (Зиновьев С.В. 2012). Таким образом, указанные нами гистохимические методы являются подходом для исследования хелатных соединений биофлавоноидов с катионами металлов в тканях и микроциркуляторном русле органов дыхания, а так же отражают участие аскорбиновой кислоты в метаболизме дигидрокверцетина, которое локализовано в стенке вен органов дыхания, что может объяснить адаптивную активность биофлавоноидов. Следует учитывать, что ализариновый красный С обладает собственным антиоксидантым механизмом воздействия на мембраны клеток, при этом доказано, что он усиливает позитивное воздействие биофлавоноидов на организм. По мнению других исследователей, ализарин, пурпурин и другие соединения антрахинонового ряда способны взаимодействовать с гемосодержащими белками, например пероксидазой (Arrieta-Baez D. et all. 2002). В такой ситуации обращает на себя внимание специфическое прокрашивание кровеносных сосудов и клеток крови ализариновым красным С. В случае дитизона и ализаринового красного С, пурпурина выводы о специфичности гистохимической реакции сделаны на основании витального прижизненного окрашивания органов и тканей, которое производилось путем скармливания или внутрибрюшинного введения реагентов экспериментальным животным. При этом по данным специалистов в области неорганической химии дитизон, ализарин красный С обладают способностью к взаимодействию с большим спектром ионов металлов и др. В то же время упомянутые гистологические красители являются перспективными лекарственными веществами, или вызывать в экспериментальных условиях диабета, заболевания почек. Выявление ионов кальция и железа с помощью ализаринового красного С, того, оспаривается, ввиду того, что антрахиноны взаимодействуют с алюминием, медью, кобальтом, и др. металлами. В то же время ализарины являются перспективными антиоксидантами, которые обладают фармакологической активностью сравнимой с токоферолом и витамином А. по данным литературы комплексное воздействие ализаринами, антрахинонами, биофлавоноидами на организм обладает эффективной антиоксидантной активностью, что в свою очередь позволяет осуществлять профилактическое лечение опухолевых заболеваний (ZhangL.W., WangJ.S., JiangC.Q.,2004, Manish Kumar , Madhu Chandel, Subodh Kumar, (2012); Naeimi H., Namdari R. Rapid, 2009; Johnson R.K., Zee-Cheng R.K., Lee W.W.,et all. 1979; Duan Y., Yu J., Liu S., Ji M., 2009; Kaur P., Chandel M., Kumar S., Kumar N., et all., 2010; Takahashi E., Marczylo T.M., Watanabe T., Nagai S., Hayatsu H., Negishi T., 2001; Jin R, Bao H., Bai Y., Li X., 2011; Lin H., Zhang Y.-W., Zheng L.-H., et all., 2011; Jasril N.H., Lajis L.Y, Mooi M.A., Abdullah M.A., et all. , 2003; Svetlana R.J., Sefedin F., Sehovic, N.T., et all. ,2012; Bhardwaj A., Gandhi R.K.; Khanduja K.L., 2001; Shen Jian et all.1997 ; Malterud K.E., Farbrot T.L., Huse A.E., Sund R.B., 1995; Tzeng T.F., Lu H.J.., Liou S.S., Chang C.J., Liu I.M..,2012; Pharmazie Scheibler P. . 1997; Yen G.-C.; Duh P.-D., Chuang D.-Y.2000; Singh R., Geetanjali Chauhan S.M., 2004). По этому гистохимическое исследование ализаринового красного С, в качестве цитологических красителей клеток, выявляющих специфические процессы в коррекции биофлавонидами и дигидрокверцетином адаптации и патологии обладает фундаментальной значимостью, для морфологии, физиологии, медицины. Учитывая высокую информативность кристаллографического исследования нативных биологических жидкостей, можно предположить, что способ кристаллографического исследования цитологических мазков и гистологических срезов органов может претендовать на роль гистохимической нормы. Мы считаем, что для гистохимии арборизация-кристаллизация биологических жидкостей, которая развивается в гипотонических условиях в случае патологии, гормональных реакций, имеет принципиальное значение, так как доказывает фундаментальный характер отложения продукта гистохимической реакции на биоструктурах. Считается, что тепловое движение фосфолипидов цитологических мембран, является ведущим молекулярным механизмом адаптации (Хочачка П., Сомеро Дж. 1988, Луценко М.Т.; 1999). В связи с этим обращает нас себя внимание, что, по мнению большинства авторов, в отношении теплового движения молекул, арборизация биологических жидкостей является энтропийным процессом (Шатохина С.Н., Зенгер В.Г., 2004). В отличие от мнения большинства исследователей о том, что натрий хлорид является основным фактором симптома арборизации биологических жидкостей, мы установили выраженную кристаллизацию гипотонических смывов назального секрета, орального секрета в случае воздействия общего охлаждения на организм человека. С нашей точки зрения проблема кристаллографического исследования биологических жидкостей человека является перспективным фундаментальным направлением современной морфологической и клинико-лабораторной диагностики здоровья, который по своей информативности приближается информативности исследования ядрышка и митотического деления клетки. Таким образом, сейчас появилась возможность объяснить ряд гистохимических реакций ввиду того, что сейчас появились новые данные: а) о свойствах биофлавонидов к образованию хелатных соединений с ионами ряда металлов; б) антиоксидантных свойствах ализаринового красного С; в) нанокристаллах; г) нанобактериях.



Рис. № 1. Гранулярное окрашивание эритроцитов в случае реакции Стиасни-Ванилин. Коррекция дигидрокверцетином общего охлаждения крыс в течение 3 месяцев. Фиксация в парах формалина. Мазок периферической крови крыс. Ув 1250.



Рис. 2. Полихроматофильные эритроциты периферической крови крыс подвергнутых холодовому стрессу в течение трех месяцев. Эритроциты слабо-окрашены нитратом серебра. Фиксация в парах формалина. Окр. метод Chinoy N. J. 1969 и докрашена Азуром. Ув.1250.


Рис. 3. Гранулярное окрашивание эритроцитов и сегментоядерного лейкоцита периферической крови крыс при коррекции дигидрокверцетина холодового стресса в течение трех месяцев. Эритроциты слабо-окрашены нитратом серебра. Фиксация в парах формалина. Окр. метод Chinoy N. J. 1969 и докрашена Азуром. Ув.1250.



Рис. 4. Гранулярное окрашивание эритроцитов и лимфоцитов периферической крови крыс при коррекции дигидрокверцетина холодового стресса в течение трех месяцев. Эритроциты слабо окрашены нитратом серебра. Фиксация в парах формалина. Окр. метод Chinoy N. J. 1969 и докрашена Азуром. Ув.1250.



Рис. № 5. Окрашивание ализарином ядра лейкоцитов. Коррекция дигидрокверцетином общего охлаждения крыс в течение 3 месяцев. Фиксация в парах формалина. Мазок периферической крови. Окрашивание по Мак-Ги Расселу. крыс. Ув 1250.


Рис. № 6. Окрашивание ализарином цитоплазмы лейкоцитов. Коррекция дигидрокверцетином общего охлаждения крыс в течение 3 месяцев. Мазок периферической крови. Влажная окраска спиртовым раствором ализаринового красного С (ЦНИЛ). Ув 1250.



Рис. № 7. Гранулярное окрашивание эритроцитов. Коррекция дигидрокверцетином холодового стресса. Мазок периферической крови. Влажная окраска спиртовым раствором ализаринового красного С. Ув 1250.



Рис. № 10. Гранулярное окрашивание эритроцитов. Коррекция дигидрокверцетином холодового стресса. Мазок периферической крови. Влажная окраска спиртовым раствором ализаринового красного С при использовании в качестве протравы бихромата калия (ЦНИЛ). Ув 1250.



Рис. № 8. Клетка плоского эпителия содержащегося в оральном секрете человека при воздействии низких температур на организм. В цитоплазме обнаруживаются включения содержащие кальций и железо. Витальная окраска ализариновым красным С. Увеличение 1250.


Рис. № 9. Арборизация назального секрета. Отложение округлых кристаллов сурьмянокислого Na+ на поверхности кристаллов в гипотоническом мазке назального секрета человека при воздействии низких температур на организм. Фиксация в парах формалина. Окраска по пироантимонатом калия. Увеличение 1250.



Рис. № 11. Отложение Na+ , кальция и др. на поверхности колоний микроорганизмов в гипотоническом мазке орального секрета человека при воздействии низких температур на организм. Окраска по пироантимонатом калия. Фиксация в парах формалина. Увеличение 1250.


Рис. № 12. Отложение цинка и др. и др. на поверхности колоний микроорганизмов в гипотоническом мазке орального секрета человека при воздействии низких температур на организм. Окраска дитизоном. Увеличение 125.





Рис. № 13. Выраженная арборизация мокроты. Отложение микроорганизмов на поверхности клеток плоского эпителия. Мазок мокроты пациента с хронической обструктивной болезнью легких. Фиксация в парах формалина. Увеличение 1250.




Рис. № 14. Обработанный концентрированной соляной кислотой мазок бронхоальвеолярного лаважа пациента с хронической обструктивной болезнью легких (Кристаллы мочевой кислоты, натрия хлорида. Неокрашенный препарат, фиксация в парах формалина. Отмыт бидистиллированной водой и ацетоном. Увеличение 100



Рисунок № 15 . Обработанный концентрированной соляной кислотой мазок бронхоальвеолярного лаважа пациента с хронической обструктивной болезнью легких Неокрашенный препарат фиксация в парах формалина. Отмыт бидистиллированной водой. Увеличение 100.




Рисунок № 16. Гипотонический мазок назального секрета здорового человека (кристаллы цистеина) обработанный концентрированной соляной кислотой. Окрашенный краской Романовского-Гимза препарат, фиксация в парах формалина. Отмыт бидистиллированной водой и ацетоном. Увеличение 100.


Рисунок № 17. Обработанный концентрированной соляной кислотой мазок БАЛ человека с острой пневмонией (кристаллы урата аммония). Окрашенныйкраской Романовского-Гимза препарат, фиксация в парах формалина. Контроль. Отмыт бидистиллированной водой. Увеличение 100.


Рис. № 18. Клетки многослойного плоского эпителия в гипотоническом мазке орального секрета человека при воздействии низких температур на организм. В цитоплазме содержатся базофильные тельца. Фиксация в парах формалина. Окраска по Романовскому-Гимза. Увеличение 1250.



Рисунок № 19. Обработанный концентрированной соляной кислотой мазок БАЛ человека с ХОБЛ (кристаллы уратов и -слабо базофильные). Окрашенный краской Романовского-Гимза препарат, фиксация в парах формалина. Отмыт бидистиллированной водой. Увеличение100.



Рис. № 20. Отложение сферолитов

на ороговевшей эпителиальной клетке в гипотоническом мазке назального секрета человека при воздействии низких температур на организм. Фиксация в парах формалина. Окраска по Романовскому Гимза. Увеличение 1250.




  1   2   3   4   5   6

перейти в каталог файлов


связь с админом